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研究紹介

 免疫感染病態講座では、当講座や検査部のスタッフや大学院生が協力をして、主に感染症とリウマチ・膠原病に関する研究を行っている。各研究者は、頻繁に情報交換を行い、それぞれの研究が円滑に、かつ、アクティブに進展するように心掛けている。全ての研究は定期的に行われるリサーチカンファレンスで岡山昭彦教授が総括し、適切な研究計画が十分に吟味されている。そこで行われるディスカッションにより、研究遂行に対するモチベーションが常に高く維持されている。個々の研究内容は以下に示すが、どれもup to dateなデータを追求し、関連学会での発表も精力的に行なうよう心掛けている。

基礎研究

【主なリウマチ・膠原病研究】

 難病である自己免疫疾患の病態解明を研究テーマとして取り組んでいる。インフォームドコンセントを得た患者さんのご協力を得ながら臨床研究や基礎研究を進めており、"bed to bench, bench to bed"を心掛け、研究の成果がより多くの患者さんに貢献できるよう日々努力している。

1. 治療抵抗性関節リウマチ(RA)とHTLV-1感染

 関節リウマチ(RA)患者の病状を悪化させ、抗サイトカイン療法に対して治療抵抗性を示す一つの要因としてヒトTリンパ向性ウイルス1型(HTLV-1)感染が検討されている。

 前述したように、HTLV-1は,成人性T細胞性白血病(ATL)や神経変性疾患であるHTLV-1関連性脊髄症(HAM)の原因として知られるレトロウイルスである。本邦にはHTLV-1高浸淫地域が存在し、同地域ではATLやHAM以外にもぶどう膜炎、関節炎、膠原病や慢性肺疾患など種々の慢性炎症性疾患に本ウイルスキャリアが認められる。

 RAは、関節破壊を特徴とした慢性炎症性疾患で、近年、炎症性サイトカインを標的とした抗サイトカイン療法(生物学的製剤)が高い有効性を示している。しかしながら、一部のHTLV-1陽性関節リウマチ患者が抗サイトカイン療法に治療抵抗性であり、徐々にその病状が悪化したことを報告した(Umekita K, et al. Arthritis Care and Research, 2013. E-pub ahead of print)。別の解析でも、抗TNF製剤を導入された症例の保存検体を用いてHTLV-1抗体のスクリーニングを行い、HTLV-1陽性関節リウマチ患者の臨床的特徴を解析したところ、HTLV-1陽性RA患者では、代表的炎症マーカーであるCRPが有意に高値であり、抗TNF療法による疾患活動性スコア(DAS28)の改善(低下)が得られにくいことが判明した(下図)。

 これらの結果によりHTLV-1感染が何らかの免疫学的機序によってRAの病態を修飾し、病勢を悪化させる可能性が考えられた。特にHTLV-1は、CD25+、 CD4+T細胞(制御性T細胞)に感染すること、HTLV-1プロウイルスに組み込まれたTax遺伝子やHBZ遺伝子から翻訳されるタンパク質は、免疫系に影響を与え慢性炎症の要因となることも報告されている(Yamamoto-Taguchi N,et al. PLoS Pathog. 9:e1003630,2013)。HTLV-1感染がRAの病態を修飾する分子生物学的機序を探索し、HTLV-1感染が原因と考えられる自己免疫疾患の発症機構や新規治療標的分子の解明を目的として研究を遂行している。
(担当:梅北、高城)

2. Long noncoding RNAによるT細胞の活性化調節機構の解明

(研究背景)近年、noncoding RNAの一つであるmicroRNAがSLEや関節リウマチの疾患マーカーや治療のターゲットとして注目されている。我々はこれまで関節リウマチ滑膜細胞におけるlong noncoding RNA(LncRNA)によるエピジェネティックプログラムの制御を研究し、LncRNAが炎症性サイトカインの産生や細胞増殖を制御することを明らかにした(図1A-C.業績1,2参照)。LncRNAもnoncoding RNAの一つであるが、microRNAよりも長い塩基配列を有し、microRNAとは異なる作用機序で様々な細胞の機能を修飾する可能性が示唆されている(図2)。しかしながら、膠原病リウマチ性疾患の病態におけるLncRNAの役割については不明な点が多い。

(研究目的)膠原病リウマチ性疾患など自己免疫疾患の発症においてT細胞の活性化が重要であることが報告されている。活性化T細胞におけるLncRNAの発現や機能を解析し、膠原病リウマチ性疾患の発症メカニズムや新たな治療ターゲットとしてのLncRNAの可能性を明らかにする。

(今後の展望)LncRNAは様々なエピジェネティックプログラムを制御していることから、T細胞の活性化、細胞増殖においてLncRNAが重要な機能を有している可能性が高い。T細胞を制御するLncRNAの機能を解析することで、膠原病リウマチ性疾患を始めとする自己免疫疾患におけるT細胞の活性化機構の理解が進むと考える。更に、本研究によって新たな治療ターゲットとしてのLncRNAの位置づけが明らかになる可能性も考えられる。
(担当:梅北、岡山)

図1.Long noncoding RNANRONによる関節リウマチ滑膜線維芽細胞(RASF)の活性化制御機構

Long noncoding RNANRONによる関節リウマチ滑膜線維芽細胞(RASF)の活性化制御機構

A. RNA干渉によるLong noncoding RNANRONの発現抑制によって核内転写因子NFAT5の核移行が誘導される(Western blott).
B. NRONのRNA干渉によるNFAT5の細胞内局在を蛍光免疫染色で解析した。
C. NRONのRNA干渉によってRASFの炎症性サイトカインmRNAの発現が増加した。

図2.Long noncoding RNAのエピジェネティックプログラム制御機構

Long noncoding RNAのエピジェネティックプログラム制御機構

  1. Umekita K, Trenkmann M, Kolling C, et al. Long Noncoding RNA NRON regulates the cytoplasmic-nuclear shuttling and activity of NFAT5 in rheumatoid arthritis synovial fibroblast. 2013 ACR/ARHP Annual Meeting. Rheumatoid Arthritis-Pathogenetic Pathways (31c). 2013. (Oct 25-30(30presentation), San Diego Convention Center)
  2. Umekita K, Trenkmann M, Kolling C, et al. The feedback loop between Long Noncoding RNA NRON and NFAT5 regulates the inflammatory response of rheumatoid arthritis synovial fibroblasts. 2014 EULAR. 2014, Jun 11-14, Paris.
3. 関節リウマチ(RA)における免疫調節因子としてのラクトフェリン(LTF)の機能解析

 関節リウマチは関節破壊を特徴とした慢性炎症性疾患である。男女比1:2と女性に多く発症し、有病率0.5%(本邦では7~10万人)と患者数の非常に多い疾患である。近年、関節リウマチに対する炎症性サイトカインを標的とした抗サイトカイン療法(生物学的製剤)が高い有効性を示しているが、これら薬物療法に対して治療抵抗性あるいは臓器合併症のため薬物療法が困難な関節リウマチ患者も多く存在する。

 このような関節リウマチ患者に対して、末梢血を循環する活性化白血球を除去し、炎症病態を改善する目的で開発された体外循環治療 白血球除去療法(LCAP)が一定の効果を示している(Umekita K, et al. Mod Rheumatol 2013, E-pub ahead of print)。そして、治療抵抗性を示す関節リウマチ(RA)患者に対するLCAP治療によって、末梢血のラクトフェリン(LTF)濃度が上昇し炎症症状が改善する可能性を報告している(Miyauchi S, et al. Rheumatology 2014, E-pub ahead of print)。

 LTFは、母乳、唾液、涙液など外分泌液に含まれる糖タンパクである。血液細胞では主に好中球の細胞質顆粒に存在し、特に細菌感染局所において活性化好中球からLTFは放出され、その鉄のキレート作用による殺菌効果が報告されている。また、エンドトキシンで誘発される単球のサイトカイン産生を制御することも報告され、LTFは抗炎症物質あるいは免疫調節物質として注目されている。

 関節リウマチ末梢血には、活性化T細胞が循環しており、LCAPによってT細胞の活性化が抑制されることが報告されている。したがって、LCAPによって患者末梢血に増加したLTFが活性化した免疫担当細胞を制御し、関節リウマチの病態を改善する可能性が考えられる。現在、LTFが免疫担当細胞の活性化や分化に与え、RAの病態を修飾する分子生物学的機序を探索し、LTFによる自己免疫疾患の発症機構や新規治療標的分子の解明を目的とし、研究を遂行している。
(担当:宮内、梅北)

4. 炎症性肺疾患におけるマイクロパーティンクル(MPs)の解析

 間質性肺炎(IP)は原因不明の病態であり、予後不良なものがある重要な疾患である。またマイクロパーティクル(MP)は細胞由来の小胞であり、活性化白血球や血小板、滑膜細胞、内皮細胞より放出される新規の情報伝達物質である。現在、MPがIPの病態形成に関与しているか否かを明らかにし、その臨床応用・治療へと展開するために研究を行っている。IPおよび感染症、サルコイドーシスの患者を対象とし、血液および気管支肺胞洗浄液(BALF)を対象としてFACSを用いたMPの測定を行った。その結果IPにおいてBALF中のMPは測定感度以上に増加しており、サルコイドーシスに比して高かった。またMP濃度はBALF中の総細胞数、特にリンパ球数と性の相関を認めたが、病勢をあらわすと考えられる好中球数やLDH濃度とは相関していなかった。これらの結果からBALF中のMPは、むしろ抗炎症性に働いている可能性が考えられた。今後、BALF中の制御性T細胞等とのマーカーと比較することで、より臨床に役立つ情報が得られるよう、検討を行う予定である。
(担当:長友、梅北)

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【主な感染症研究】

 主にHTLV-1(human T-cell leukemia virus type I)感染による成人T細胞白血病(ATL)発症に関連する遺伝子・蛋白質の機能解析を行っている。ATLはHTLV-1感染T細胞が数十年の長い潜伏期間を経てモノクローナルに増殖し腫瘍化したものである。HTLV-1感染者の多くはATLを発症せずに健常な状態で一生を経過するキャリアであるが、その一部が感染後長い潜伏期を経てATLを発症する。ウイルス単独での感染力は弱く、感染は細胞-細胞間感染を介して、ウイルスゲノムは非感染細胞に感染し、引き続き感染細胞のクローン増殖が起こる。その感染・発症メカニズムについてのより詳細な研究を進めている。(→ 1. HTLV-1欠損プロウイルスの解析)

 また、附属病院検査部細菌検査室と協力して、当院におけるMRSA・多剤耐性緑膿菌・結核菌などの検出状況を定期的に集計し、感染症診断における病原微生物鑑別の検討や院内感染対策活動に利用している。そこで得られた情報が感染症診療の向上に結びつくことを目指し、研究を行っている。(→ 2. 鑑別困難な感染症に対する新規診断法の開発、3. SFTS診断法の検討)

1. HTLV-1欠損プロウイルスの解析
HTLV-1完全型プロウイルスと欠損プロウイルス

 これまでにInverse long PCR法による解析でHTLV-1プロウイルスのクローナリティの収束がHTLV-1感染率の増加と共にATL発症リスクに関与することを明らかにしてきた。ATLの約30-50%の症例でプロウイルスの一部が欠損していることが知られており、それらはプロウイルスの5'-LTRが残存し、gagからenv領域の一部が欠失する1型欠損と5'-LTRも欠失する2型欠損に分類されている。この欠損を有する感染細胞はウイルス抗原(tax)の発現が低下することにより宿主の細胞免疫システムから回避し、結果として生きのびた細胞が特異的に増殖し、ATLの病態が誘導されることが示唆されている。更に、急性型やリンパ腫型で2型欠損プロウイルスが多く認められていると報告されており、HTLV-1キャリアのプロウイルスが2型欠損であることは、特に急性型やリンパ腫型などのATL発症の重要なリスクファクターであると推定される。我々は高プロウイルス量を示すHTLV-1キャリアでは、欠損プロウイルス保有細胞のクローナルな増殖が認められることや母児間感染キャリアでは、配偶者間感染キャリアよりもgag領域に欠損や変異をもったプロウイルス保有細胞が多いことを見出している。HTLV-1感染細胞株間ではプロウイルスの組み込み部位や量、プロウイルス遺伝子発現に多様性が認められ、欠損プロウイルス発現のメカニズムの機序解明及び感染能の解明など検討している。(担当:橋倉、岡山)

2. 鑑別困難な感染症に対する新規診断法の開発

 臨床的に発熱を主訴とする患者は最も多く、その第一原因は感染症である。しかしながら肺炎や菌血症のようにコモンな感染症であっても、その起炎菌の同定率は低い。これは感染症の原因が多彩であり、嫌気性菌や抗菌薬の影響、細胞内寄生体で培養困難な感染症の頻度が高いことによる。古典的なグラム染色、培養法に加えて、菌体成分をスライド標本からレーザーマイクロダイセクション(LMD)法を用いて、直接回収し、細菌あるいは真菌の16sリボゾーマルRNA(16SrRNA)遺伝子を増幅する方法を確立し、菌種同定への応用を試みている。更に免疫不全マウスなどの含めた動物への検体接種を組み合わせることにより一般に困難な細胞内寄生体の検出も試みることで病原体診断率の飛躍的向上を目指している。(担当:山田、岡山)

3. SFTS診断法の検討

 近年Severe fever with thrombocytopenia syndrome(SFTS)のウイルスが分離され、研究室内での確定診断が行われるようになったが、設備等の関係で限られた施設でしか実施出来ない。病院検査室でのSFTS検査実施の可能性を検討するため、SFTSウイルスの各フラグメントを個別に蛋白質を発現させ、それを抗原にしたSFTS抗体検査法の開発、抗体作成によるウイルス抗原の検出法の開発を試みる。

  1. SFTSウイルスのL, M, Sフラグメント遺伝子のcDNAを大腸菌、昆虫細胞、ほ乳類細胞に導入し、遺伝子産物を個別に産生させ精製する。
  2. 精製した蛋白質抗原を酵素等で標識し、酵素免疫測定法を作成する。
  3. 得られたウイルス蛋白質を免疫源として動物に免役しSFTSウイルス特異抗体を作成する。それらの抗体を標識し、ウイルス抗原検出測定法を開発する。
  4. また、ウイルス蛋白質を用いてほ乳類細胞に及ぼす影響を調べる。

(担当:梅木、岡山)

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【その他の研究】

 附属病院検査部の元技師長である荒武八起先生は、長年来取り組んでこられた甲状腺腫瘍の病態解明と検査法開発を研究テーマとして現在も精力的に研究を進めている。また、病理検査の過程で得られた興味深い症例の検体を用いて、新規の細胞株を樹立し、それを用いた腫瘍メカニズムの解析を行うことで、得られた成果をより多く臨床検査に反映すべく研究に取り組んでいる。

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臨床研究

 当講座では、倫理委員会の承認のもと、患者の皆様の協力を頂き、以下に示すような臨床研究テーマに取り組んでいる。

1. 膠原病一般の臨床研究

 現在でも原因が不明である膠原病およびその類縁疾患について、膠原病の発病のメカニズムやより良き診断法や治療法を確立するための研究を行っています。

2. HTLV-1感染と炎症性疾患の研究

 ヒトリンパ向性ウイルス1型(HTLV-1)は成人T細胞白血病(ATL)やHTLV-1関連脊髄症(HAM)の原因ウイルスとして研究されてきました。また、このウイルスはリウマチのような関節炎、膠原病、慢性の肺疾患、眼の病気であるぶどう膜炎など稀な病気との関連が疑われてきましたが、その詳細な発症機序はわかっていません。HTLV-1感染がこのような病気に関わるのか、このウイルスを持っている患者さんでは経過や治療効果が異なるのか等について、病気の予防や治療に役立てるための研究を行っています。

3. ATL発症高危険群の同定と発症予防法開発を目指す研究

 日本全国には100万人を超えるHTLV-1キャリアが存在するとされますが、宮崎県はHTLV-1感染者が多く、県民の健康問題として重要と考えております.多施設共同研究 Joint Study on Predisposing Factors of ATL Development(JSPFAD)に参加してATL発症高危険群の同定と発症予防法開発を目指す研究に取り組んでいます.

4. 全身性エリテマトーデスの病因解明の研究

 全身性エリテマトーデス(SLE)は20~30歳代の女性に発症し、皮膚、関節、神経、内臓などの全身臓器に障害が起こる原因不明の自己免疫疾患です。当講座では理化学研究所と協力してSLEやその類縁疾患の発病に関わる可能性のある遺伝子について研究を進めています。

5. 重症熱性血小板減少症候群ウイルス(SFTSv)についての臨床的な基礎研究

 2013年に日本初の重症熱性血小板減少症候群(SFTS)患者が発見されました。全国でもSFTS感染症の届出は宮崎県が最多という状況でした。当講座では、国立感染症研究所にて行われる疫学調査や中和抗体の開発へ協力し、また早期診断に有用な検査方法の開発を進めています。

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